1.禾本科植物EPF信号肽家族的鉴定及表达模式
通过搜索大量公开的基因组和转录组序列数据库，在谷类植物中鉴定了拟南芥EPF家族信号肽的同源物。系统发育分析显示，在6种草本植物中，每个单倍体基因组中都有11-15个基因编码假定的EPFs(图1)。小麦(Triticumaestivum)是一种六倍体小麦，有13个同源基因，除其中一个只有两个同源基因拷贝外，每一个都有3个同源基因拷贝。为了研究禾草EPF同源物在生长发育中的潜在作用，作者采用实时定量(q)PCR分析了两个禾本科物种小麦(T.aestivum)和Brachypodium中每个EPF基因在不同器官和发育阶段的表达模式(图2A,B)。根据之前在拟南芥中发现的AtEPFL4和AtCHALLAH/AtEPFL6的草同源基因(Bd1g,Bd4g,Bd2g,Bd2g,TraesCS1D02G,TraesCS4A02G和TraesCS3A02G)，它们在拟南芥中调控花序生长。在短叶柄和小麦花序茎中也有表达。这表明它们可能在禾本科花序发育中起类似的作用。同时这些分泌的EPF肽在禾草中具有活性，并可能在双子叶和单子叶的各种发育过程中具有保守的功能。图1禾草EPF家族多肽系统发育树。
图2EPF家族成员在短柄草和小麦中的表达模式。
2.禾草EPF1/EPF2同源物回补拟南芥EPF2突变体的表皮表型。
进一步的研究结果证明，草类EPF1/EPF2-like基因的过表达限制了气孔世系的启动，而拟南芥中STOMAGEN-like基因的过表达促进了气孔的发育（图3）。图3拟南芥中禾草气孔EPF同源基因的异位表达表现出气孔发育缺陷。
随后作者在拟南芥突变体（epf1/epf2）中表达来自小麦和短柄草的两个EPF1/EPF2类基因。epf1突变体表现出先前报道的轻度气孔聚类表型，这是由于气孔间距划分缺陷造成的(图4A,M)。不同于阳性对照(epf1中有AtEPF1;图4B,M)，表达禾草EPF1/EPF2同源基因(AtEPF1pro::BdEPF2-1,AtEPF1pro::BdEPF2-2,AtEPF1pro::TaEPF1和AtEPF1pro::TaEPF2)都不能抑制EPF1的配对气孔表型(图4A-F,M;图S5)，表明拟南芥中，无论是小麦还是短柄草EPF1/EPF2-like基因都不能取代AtEPF1的功能。作者筛选来自小麦和短柄草EPF1/EPF2样基因，以互补epf2的表皮表型，其中epf2表现出表皮细胞过度的分裂，导致非气孔细胞密度显著增加(图4G,N)。这与epf2中的AtEPF2pro::AtEPF2相似(图4H,N)，内源性AtEPF2启动子(AtEPF2pro::BdEPF2-1,AtEPF2pro::BdEPF2-2,AtEPF2pro::TaEPF1和AtEPF2pro::TaEPF2)驱动的所有禾草EPF1/EPF2同源基因显著挽救了epf2突变体的表皮表型(图4G-L,N)。这些结果与表明，小麦和短柄草中两个与AtEPF1/AtEPF2最相似的同源基因中的任何一个都可以替代AtEPF2，但不能替代AtEPF1在拟南芥中的功能。图4草EPF1/EPF2同源基因对拟南芥epf2突变体的互补。
3.具有生物活性的禾草EPF肽在拟南芥和短柄草幼苗中引发了气孔发育缺陷
该研究以具有生物活性的成熟EPF肽(MBdEPF2-1、MBdEPF2-2和MBdSTOMAGEN-1)处理的短梗草幼苗(Bd21-3)为材料，研究了这些EPF肽对拟南芥气孔形态和模式的调控作用。BdSTOMAGEN-2在拟南芥中与BdSTOMAGEN-1在气孔发育过程中存在功能冗余(图2A，图3G,H,M)。作者主要集中在短柄草的EPF肽上，因为在上述实验中，小麦和短柄草的气孔EPF同源基因产生了相似的表型(图3,4)。使用MBdEPF2-1或MBdEPF2-2肽使拟南芥表皮完全没有任何气孔系细胞，导致只有表皮细胞组成，这与诱导过表达AtEPF2的表型相同(图5C,F,G)或重组AtEPF2转入拟南芥幼苗。相比之下，化学合成的MBdSTOMAGEN-1处理拟南芥幼苗可促进气孔发育和聚类，这一表型类似于诱导AtSTOMAGEN过表达(图5D,H)或生物活性AtSTOMAGEN处理。接下来的研究，作者发现短柄草EPF肽对拟南芥气孔发育产生了影响（图5）。表明，AtEPF2和AtSTOMAGEN的同源基因可能也参与了禾草的气孔启动调控，其中MBdEPF2多肽作为气孔发育的抑制剂，而BdSTOMAGENs作为气孔发育的促进因子。图5短柄草活性肽对表皮发育的影响。
4.多拷贝的禾草EPF肽，BdEPF2和BdSTOMAGEN，对于禾草的气孔发育是竞争关系
考虑到BdEPF2-1和BdEPF2-2都能抑制草的气孔启动，而BdSTOMAGEN则作为气孔诱导信号，作者研究了BdEPF2多肽是否被BdSTOMAGEN多肽抑制。在短柄草野生型幼苗上应用MBdEPF2-1或MBdEPF2-2肽如前所述抑制了气孔发育，但通过与浓度增加的BdSTOMAGEN-1肽共孵育，无气孔表型以剂量依赖的方式恢复到具有气孔的接近正常的表皮(图6)。作为对照实验，作者合成了另一个短柄草中的EPF同源多肽MBd2g，MBd2g处理下的拟短柄草幼苗没有表现出与BdSTOMAGEN处理相同的结果。这表明BdSTOMAGEN对气孔的诱导是特异性的。图6BdEPF2的活性被短柄草BdSTOMAGEN-1的活性拮抗。
MBd2g肽溶液对拟南芥和短柄草幼苗的处理表明，Bd2g肽与本研究的禾草EPF肽不同，在气孔发育中没有作用。将Bd21-3幼苗置于具有生物活性的MBdEPF2-2和更高浓度的MBd2g多肽混合物中，并没有影响MBdEPF2抑制短柄草气孔发育的能力（附图7,10见原文）。表明，正调控因子MBdSTOMAGEN对MBdEPF2处理的两种无气孔短叶草表皮的影响是它们在控制草气孔发育过程中特异性拮抗行为的结果。参考文献：
JangraR,BrunettiSC,WangX,KaushikP,GulickPJ,ForoudNA,WangS,LeeJS.DuplicatedantagonisticEPFpeptidesoptimizegrassstomatalinitiation.Development.Aug15;(16):dev.
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